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本试剂盒适用于从各种原代或传代培养细胞培养上清样品中提取总外泌体。不需要超速离心，仅需通过简单的常规离心即可从样本中获取大量结构完整的外泌体，具有快速简单，提取效率高的特点，可节省更多的实验时间和样本。提取的外泌体可根据实验目的用于后续的多种实验，应用范围广泛。

传统的体外培养的细胞中分离和提取exosome的主要方法是超速离心法，这种方法缺点是耗时耗力，往往需要30～70个小时，每次最多只能处理6个样品，需要大量的起始材料，而且产量不高。

我们公司自主开发的外泌体快速提取试剂盒系列产品，可以通过简单离心快速高效获得高纯度外泌体颗粒。本试剂盒提取的外泌体完好无缺，能用于各种功能研究、蛋白分析及RNA分析等下游应用实验。

外泌体是活细胞分泌的来源于晚期核内体(也称为多囊泡体)的膜性小囊泡，直径约为30～150nm，天然存在于血液、唾液、尿液和母乳等各种体液中，研究发现，Exosome内含有与细胞来源相关的蛋白质、mRNA和microRNA，并且exosome能够通过生物屏障，在细胞间传递功能性核酸分子，从而发挥各种生物学功能。

外泌体囊泡已经成为细胞间通讯的重要介质，参与原核生物和高等真核生物细胞之间的生物信号传递，以调节不同范围的生物过程。外泌体囊泡的病理生理作用开始在包括癌症、感染性疾病和神经变性疾病在内的疾病中得到充分认识，显现了外泌体作为疾病的早期诊断、治疗干预的潜在新靶点的巨大应用前景。此外，未修饰和工程化的外泌体囊泡可能在大分子药物递送中具有应用价值。

• 使用方便，无需超速离心，省时省力；
  
• 纯度高，富集量大，应用范围广；
  
• 获取的Exosome结构和功能完整；
  
• 稳定性好，便于运输，便于保存。

• 可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂。
  
• 以下以4mL培养基为例，实际操作时按培养基和提取液A用量体积比4：1使用即可。
  
• 不同细胞分泌的外泌体数量差异极大，请根据实际情况选择培养基样品的量，根据下游应用和参考文献确定。条件允许的情况下采用尽可能多的细胞培养上清。
  
• 一般巨噬细胞、淋巴细胞、造血细胞、胰腺癌细胞等分泌外泌体较多，其它细胞样本建议每个样培养基上清用量不少于8mL。常规的细胞样本最佳培养上清上样量为15～20mL及以上，条件允许的情况下采用尽可能多的细胞培养上清。
  
• 条件允许的情况下可以将细胞培养上清浓缩后再提取外泌体。
  
• 在收获细胞时，应确定死亡细胞不超过5%。细胞凋亡/死亡过程中会释放大量大小不等的囊泡，它们在外泌体的提取过程中会污染活细胞产生的外泌体。
  
• 已经分离好的外泌体样本如果需要进行电镜观察，只能冰上或4℃保存，存放时间不超过两天，注意不可冷冻保存，否则可能会影响电镜观察效果。

• 收集4mL待提取的培养基样品，置2～8℃保存。
  
  • 冻存样品置水浴锅解冻后置2～8℃保存。
• 将样品在4℃条件下，3000×g离心15分钟。弃沉淀，收集上清。
  
• 小心将上清移入另一干净离心管中。
  
• 将样品在4℃条件下，10000×g离心20分钟。弃沉淀，收集上清。
  
• 小心将上清移入另一干净离心管中。
  
• 在4mL上清中加入1mL提取液A，盖紧离心管盖，上下颠倒混匀1分钟左右，使液体充分混匀。
  
  • 试剂A使用前请充分混匀。
• 置2～8℃冰箱静置过夜。
  
  • 静置保存时间不少于10小时。
• 在4℃条件下，10000×g离心60分钟。
  
• 小心移除上清，收集沉淀。
  
  • 尽可能吸干上清。
    
  • 吸取时小心，防止吸掉沉淀。
• 取50～100μL外泌体保存液将沉淀重悬，即得到外泌体样品。
  
  • 可以不用试剂盒中的外泌体保存液试剂B，根据下游实验需要用自己的其它缓冲液重悬保存外泌体。
    
  • 也可直接用于蛋白提取。
• 将外泌体样本-80℃保存或直接用于下游应用。
  
  • 外泌体短期保存置于2～8℃保存即可，一周以上长期不用时置-80℃保存。
    
  • 保存前可以用0.22μm过滤除菌。

• 培养细胞时，如何去除血清来源的外泌体？
  多数情况下，细胞在体外培时养需要血清，而血清中一般都含有外泌体，为避免血清对细胞外泌体的污染，可采用以下3种方法：
  
  • 选择商品化的无外泌体血清进行细胞培养；
    
  • 选择无血清培养基进行细胞培养；
    
  • 将细胞培养用的血清通过100000×g超速离心10小时以上以去除血清外泌体。
• 无外泌体血清培养基（或者无血清培养基）在什么时候使用？
  细胞在正常含血清的培养基中培养一定的时间后，细胞融合度约为60%～70%时，移去原有含血清的培养基，换成新鲜的无外泌体血清培养基（或者无血清培养基），继续培养24-48h，细胞融合度达到80%～95%左右时收取上清，该上清液即可用于提取外泌体。
  
• 准备做细胞外泌体siRNA的NGS测序，初始样品量需要准备多少？
  普通肿瘤细胞系建议使用40mL以上的初始样品量。由于某些细胞（如悬浮细胞、干细胞、神经细胞等）中外泌体含量比较低，建议先将上清浓缩，准备40mL以上的浓缩液再使用本试剂盒提取外泌体。
  
• 如何鉴定提取的外泌体？
  通常使用透射电镜检测（形态）、粒径检测（大小）、外泌体标志蛋白Western blot检测等方法鉴定提取的外泌体。
  
• 外泌体WB标志蛋白用什么？
  在进行WB检测时，通常检测外泌体标志蛋白为CD63、CD9、CD81、TSG101、ALIX、HSP70等。
  
• 进行外泌体WB鉴定时有什么内参蛋白可供选择？
  没有，该检测属于定性检测。
  
• 蛋白浓度低？
  很多细胞外泌体量不够下游应用，在条件允许情况请尽可能加大培养上清的上样量。
  处理部分样本时可能没有裂解完全，导致蛋白浓度低。请选择高质量的蛋白裂解液或蛋白提取试剂盒。
  
• 抽提得到的RNA浓度低？
  很多细胞外泌体量不够下游应用，在条件允许情况请尽可能加大培养上清的上样量。